日子过得很快，达·芬奇结束了十年的学徒生活。强烈的求知欲望，驱使他对几何、物理、化学、天文、生物学都产生了浓厚的兴趣。他白天在野外观察写生，晚上在灯下埋头读书学习。
1495年，达·芬奇为米兰的一个修道院制作壁画《最后的晚餐》。
画面中的耶稣在餐桌上对他的十二个门徒说：“你们中间有一个人出卖了我。”话音刚落，全场震惊。餐桌上坐着的十二个门徒，有的大惊失色，有的义愤填膺，有的感到绝望，有的则想为自己申辩。只有一个门徒神情紧张，身体后仰，右手紧握着钱袋。他就是将耶稣出卖的叛徒犹大。在犹大的背后，是黑暗的阴影。而在耶稣的背后，却是开启的窗户，一片阳光照射进来。犹大的卑劣形象与耶稣的庄严、肃穆、泰然自若的神情，形成了强烈的对比。
达·芬奇对邪恶的憎恨和对真理的赞美，在这幅名画中表达得淋漓尽致。
在创作《最后的晚餐》的过程中，达·芬奇通常在黎明时分就来到修道院，爬上脚手架，在墙壁上辛勤地作画，直到暮色降临才停止一天的工作。他的绘画速度很慢，常常要对前一天画好的部分不断地进行修改。
为了寻找可供参考的模特，他有时几天不能动手作画。修道院副院长以为他工作拖拉，便去向米兰公爵告状。�当公爵找到达·芬奇问话时，他回答说：“这幅画还有两个头像没有画好，一个是耶稣，很难从人间找到这样神圣的仪容来做模特儿；另一个就是犹大，他的叛徒嘴脸很难表现。如果副院长催得太急的话，我只好照他那副尊容来画了。”
公爵听了哈哈大笑，并没有责备他。就这样，这幅画整整画了四年才最终完成，现在，这幅画还在那家修道院的墙上。
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