基因工程

不好意思，搞错了
一,逆转录法
逆转录法是先分离纯化目的基因的mRNA,再反转录成cDNA,然后进行cDNA的克隆表达.
1,mRNA的纯化
mRNA的特点:3'末端含有一多聚腺苷酸组成的末端.
方法:亲和层析法
2,cDNA第一链的合成
一般 mRNA都带有3'-polyA,所以可以用寡聚dT作为引物,在逆转录酶的催化下,开始cDNA链的合成.
用放射性探针法检测.
3,cDNA第二链的合成
以cDNA第一链为模板合成第二链.
4,cDNA克隆
用于cDNA克隆的载体有两类:质粒DNA和噬菌体.又将其分为表达型载体和非表达型载体.选用表达型载体可以增加目的基因的筛选方法,有利于目的基因的筛选.
cDNA片段与载体的连接通常采用下面方法:
加同聚尾连接:在载体和cDNA的3'末端加上互补的同型多聚酶序列.
人工接头连接:所谓人工接头是指用人工合成的,连接在目的基因两端的含有某些限制酶切点的寡核苷酸片断.
5,将重组体导入宿主细胞
6, cDNA文库的鉴定
7,目的cDNA克隆的分离和鉴定
(1)核酸探针杂交法
(2)免疫反应鉴定法
逆转录-聚合酶反应法.该方法是mRNA经逆转录合成cDNA第一链,不需再合成第二链,而是在特异引物的协助下,用PCR法进行扩增,特异地合成目的cDNA链,用于重组,克隆.