通过设计带酶切位点的PCR引物来使目的片段添加限制性酶切位点的原理是什么？百思不得其解，请教各位！
我的意思是说引物人为添加上的酶切位点与要扩增的片段也不匹配，怎么能随着引物克隆到目的片段上，而使目的片段带上酶切位点的序列呢？原理是什么呢？
3个回答
不是随意添加。酶切位点都加在引物的5‘端。这样在第一轮扩增后，就会产生有酶切位点的产物了(酶切位点在产物的两端）。在接下来的扩增中每个产物就都会有了。PCR的时候可以耐受引物的5‘端由数个不匹配的碱基对。但是随着扩增的进行，产物都有这些位点后，就不存在不匹配的问题了
我要知道就好了
大哥 我也没想清楚，要是你知道了，跟我也说声 什么原理啊？
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全文PCR扩增出目的片段之后为什么要酶切?酶切下来的是目的片段和载体?然后再把它们连起来?很困惑.
应为PCR扩增出来的是混合物,酶切回收后才基本是纯的目的片段. 载体一般不用PCR扩增,一般是质粒来源,也需要用切口一致的酶消化回收. 之后连起来就好了
酶切后PCR一条带都没有 但原质粒PCR有条带 为什么
什么酶呢？最后酶切组的电泳条带是弥散，是只有质粒条带没有酶切产物条带，还是干脆就是空白？ 如果是弥散，最有可能的是所用的酶的反应条件要求比较严格，因为掌握不当而产生了星号活性，导致把质粒切碎了。建议...
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基本上设计引物的时候用primer5看看就差不多了，没有非特异没有自身二级结构，然后TM计算就是AT加2GC加4，加在一起就是TM退火温度……不要有连续5个以上一样的碱基，碱基分布均匀一些……就差不多...
全文挑克隆鉴定时PCR有目的条带但是酶切没有
2中可能，1种是你的抗生素失效了，长出来都是没质粒的菌；另1种是你转化进感受态的都是空质粒。 PCR扩增有目的条带可能是因为连接产物残留的PCR片段在平板上引起的假阳性。
构建载体双酶切电泳后比目的片段pcr产物高
可能是质粒在转菌后部分碱基出现错配或者突变导致你酶切的位置发生变化.因为你pcr扩增只是你引物的位置只要不突变就可以正常扩增.建议你做个测序.
构建载体的时候，先用设计好的引物PCR所要的目的基因，再和T载体连接，再转化，再小抽，再双酶切，再和
理论上讲PCR产物可以直接酶切连接反应。 但是，以PCR产物酶切的时候没有办法证明双酶切是否成功、彻底（PCR产物会有ployA的存在必须切掉，但是PCR产物和酶切产物大小差别不大）。而以T载体为媒介...
全文连接转化后提质粒做酶切，可以切出带，做质粒PCR却P不出来，为什么
都有可能 你可以多做几个对照,如空载体转化、空细胞涂板等等，帮助缩问题小范围 你可以询问实验室其他人员，看看酶是否有问题，感受态是否有问题，抗生素是否有问题，等等 按你给的线索，菌落很少，很有可能是切...
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