阅读文章前辛苦您点下“关注”，方便讨论和分享，为了回馈您的支持，我将每日更新优质内容。
前言
双酚A和壬基酚既是化工产品生产中的重要精细化工原料，也是环境中广泛分布的污染物，其中BPA在包装材料方面应用广泛，NP则用于烷基酚聚氧乙烯醚的合成。
在塑料增塑剂、工业洗涤剂中应用广泛，BPA和NP在生物体中富集后能产生极强的雌激素效应，增加生殖系统癌症的发生率，并对胎儿、婴幼儿的发育造成不良影响，法规上，2011年5月30日，我国卫生部等6部门对外发布公告，禁止BPA用于婴幼儿奶瓶的生产。
根据目前的研究，以及2019年10月24日国家市场监管总局发布的食品补充检验方法，这些研究或方法均采用固相萃取或凝胶渗透色谱的方式对样品进行富集和净化，方法具有较好的灵敏度。
但SPE在活化、上样、淋洗和洗脱等过程需要耗费大量时间，GPC在填料溶胀、柱填充、柱平衡等过程中也繁琐费时，使用并不便捷，对分离和富集酚类常用的10种不同品牌和型号SPE柱的研究发现，无论是何种管壁材质或填料种类，BPA和NP都检出有本底。
分别采用乙酸乙酯-环己烷、乙腈-水、乙腈、水-乙酸锌溶液-甲醇作为提取溶剂直接进行溶剂萃取和蛋白沉淀，并用离心、氮吹复溶、过针式滤膜中的一种或多种方式进行净化。
这类方法的最大特点就是避免了复杂的前处理过程，但也存在一些问题，如这4个方法均未对流动相本底进行在线捕集；耿宁等的方法仅对双酚类物质进行了研究，并未检测NP；方法定量方式为外标法，存在回收率偏低的情况。
在乙酸锌沉淀蛋白后直接离心过滤膜并上机，最终样液并未进行脱盐，针式滤膜也未进行本底测试，故这些方法优劣并存，应用时较难抉择，故研究在线捕集-UPLC-MS/MS检测乳粉中BPA和NP的影响因素具有积极意义，能为乳粉中BPA和NP的检测或研究提供一定的参考。
材料与方法
色谱条件：色谱柱：ACQUITYUPLCCSHTMC18柱；捕集柱，捕集柱连接位置在比例阀和六通阀之间；柱温30℃；流动相：甲醇0.05%氨水溶液。
流速：0.25mL/min，进样量：7μL；梯度洗脱程序：0min，甲醇30%；3min，甲醇95%；7min，甲醇95%；7.1min，甲醇30%；10min，甲醇30%。
质谱条件：IonSourceType：ESI－；SheathGas：17Arb；AuxiliaryGas：9Arb；SweepGas：7Arb；CID：氩气；NegativeIonSprayVoltage：4500V；VaporizerTemp：350℃；IonTransferTubeTemp：350℃；扫描模式：MRM模式。
用蠕动泵注射适当浓度的标准品进行参数优化，采用一有机相和氨水溶液作为流动相，试验对比了甲醇、乙腈作为有机相时的响应，发现水-甲醇体系的目标化合物的响应明显较水-乙腈体系高。
且在连续注射时当甲醇流动相的比例从50%增加到95%时，目标化合物的母离子信号响应显著升高，故在甲醇:氨水溶液流动相比例下进行质谱参数优化，电喷雾负离子模式和MRM模式下，各化合物的碎片离子和二级质谱参数见下表。
色谱柱的影响
对现有的大部分检测方法进行对比，发现大多数方法中采用键合相为C18的色谱柱作为分析柱，而BEHC18色谱柱在应用上最为普遍，本文选择CSHC18色谱柱与其进行对比，结果发现，对于NP，二者保留时间和响应都接近。
而对于BPA，CSHC18色谱柱明显较BEHC18色谱柱响应更好、保留更强，这可能是因为CSHC18色谱柱固定相是在BEHC18色谱柱的亚乙基桥杂化颗粒基础上对颗粒进行表面带电杂化，而可控的低水平表面电荷拓展了色谱柱的选择性并得到更好的响应和峰形，故选择CSHC18色谱柱作分析柱。
在不考虑基质影响的情况下，通过对低、高质量浓度的标曲点分别进行体积为2～10μL的进样量试验，结果如图所示，在8μL之前，BPA的信号响应与进样体积几乎线性增加，但在8μL之后几乎不再增加，且进样量为9μL时色谱峰开始出现明显前伸。
对于NP，除了低浓度低体积进样量因信号响应较低导致峰形不佳外，其他进样体积与信号响应基本线性增加，说明色谱柱对NP的载量较高。
在综合考虑色谱柱载量预留和信号响应最大情形下，选择7μL的进样体积较为合适，在同样的加标浓度下，本文比较了BPA-D4与BPA-D16以及NP-D8与NP-13C在溶剂中和样品基质中的差异，结果如图所示：
BPA-D16与NP-D8在溶剂中的响应值要明显高于其在样品基质中的响应值，这说明存在基质抑制；而在同样的样品基质中，BPA-D4峰形更好、基线噪音更小，而BPA-D16峰左侧有较强的干扰峰且峰的分离度较差，基线噪音也较大，保留时间上BPA-D4也更接近BPA。
NP-D8与NP-13C相比，样品基质中NP-13C内标的响应值要远远大于NP-D8，从保留时间上看NP-13C与NP几乎一致，而NP-D8与NP保留时间相差0.42min，这种情况的出现可能是随着氘代数目的增多，氘代内标物的结构和极性发生食品安全与检测改变，从而导致色谱行为出现偏差。
基质效应采用提取后添加法进行评估，即基质效应因子ME=提取后的空白基质加入待测物的响应/纯溶液中待测物的响应；内标归一化后的基质效应因子MFi=待测分析物ME/内标ME。
可见BPA存在明显的基质抑制，NP则基本无基质影响；对MFi和ME进行方差同质性检验和t检验，F检验表明MFi和ME的方差F值＜F0.05=7.15，说明方差同质。
检验结果表明，BPA的t值＞t0.01=3.169，NP的t值＜t0.05=2.228，说明BPA差异极显著、NP无显著差异；即引入同位素内标后，BPA的基质抑制得到了很好的校正。
此外，试验中还发现，乳粉类别不同，BPA的基质抑制情况也有差异，如在同为空白基质的牛乳粉和羊乳粉中均加入2μg/kg的BPA和NP标准物质和10μg/kg的BPA-D4和NP-13C标准物质。
通过谱图对比，发现羊乳基质中BPA和BPA-D4的响应明显较高，且在峰的右侧基线噪音明显减小，而NP则差别不大，这种差异可能是乳粉中内源性物质差异所致。
通过对同一阴性样品进行2μg/kg水平的加标，考察不同提取溶剂对提取结果的影响，分别比较了用10mL乙腈、乙腈-水、乙酸乙酯-环己烷和甲醇的提取效果。
结果发现，乙腈-水体系的BPA出峰时间左侧有较强的杂峰，且在提取过程中乳粉易结块抱团、挂壁严重；乙酸乙酯-环己烷虽然分散性较好，但氮吹后提取出的油脂较多，BPA出峰时间右侧有较强的杂峰。
甲醇虽然分散性好、提取油脂少，但蛋白沉淀效果不如乙腈，BPA出峰时间两侧虽无较强杂峰，但对NP及其内标的的提取效果都较差，这一结果与李蔚等的试验结果基本一致，乙腈提取在氮吹后虽然也有油脂，但相对较少，且用极性较大的甲醇进行复溶时能减少响应值保留时间。
不同提取方式的影响
分别采用10mL和5mL乙腈对加标20μg/kg的BPA、NP样品进行3次提取，每次提取后单独收集提取液，在–20℃冰箱中冷冻2h，取出后于8000r/min离心5min，离心后取上清液待测，测定结果绘制成百分比堆积柱形图如下图所示。
可知第3次提取的样液中BPA和NP的响应值已相当小，当提取体积为5mL时，BPA前2次提取的峰面积占比为87.7%，NP前2次提取的峰面积占比为94.2%，从提取次数上看，对样品分2次提取足以满足需要。
而提取体积为10mL时，BPA前2次提取的峰面积占比为94.8%，NP前2次提取的峰面积占比为97.2%，可见只有BPA的峰面积占比有明显增加，而BPA采用内标法定量，能消除提取过程中的损失保障回收率，NP则不受影响。
但是合并的20mL乙腈在后续的氮吹浓缩过程中时间也会更长，综合考虑试验效率、成本等因素，采用10mL乙腈分2次对样品进行提取足以满足需要。
结论
本文通过对不同色谱柱、同位素内标、提取溶剂和提取方式等进行了试验，同时定量考察了基质效应和测定了常用试剂耗材的本底，结果发现，CSHC18色谱柱在响应上要优于诸多文献中采用的BEHC18色谱柱，保留也更强。
尤其对于BPA，不同同位素内标的对比表明，BPA-D4、NP-13C更适合做BPA与NP的内标，因为在样品基质中BPA-D16不仅受到了基质抑制，而且峰附近有较强的杂峰干扰，且分离度较差，基线噪音也更大。
NP-D8与NP-13C相比，样品基质中NP-13C的响应值要远远大于NP-D8，保留时间上NP-13C与NP几乎一致，NP-D8与NP却相差0.42min，故后续在方法开发和检测研究时应注意氘代同位素内标的影响。
对常用试剂、耗材的本底测定，发现BPA无本底检出，NP有检出，且聚丙烯注射器和尼龙滤膜中本底较高，故样品前处理过程未使用SPE和过针式滤膜的方法净化样液，而是采用提取液直接浓缩和离心的方式除杂净化。
在基质效应考察中，发现BPA基质抑制严重，且牛乳基质较羊乳基质严重，而引入同位素内标后基质抑制虽未消除，但得到了很好的校正，此外，有文献提及用氨水碱化后的乙腈和甲醇能很大程度上减小基质效应。
但经实际试验发现并无差异，具体原因有待研究，对于不同提取溶剂的影响，研究发现采用乙腈作为提取溶剂的效果相对较好，对于不同提取方式的影响，发现采用10mL乙腈分两次进行提取的方式足以满足需要。
从多方面对在线捕集-UPLC-MS/MS测定乳粉中BPA和NP的影响因素进行了分析和研究，这对后续进一步研究乳粉中BPA和NP的测定具有参考价值和积极意义。
用户评论