我的目的片段连T载体后，挑单克隆摇菌，用菌液PCR能P出目的片段，再提质粒用Ecor1做酶切，片段变小怎么回

2022-06-29 17:41

3个回答

你要看看你的质粒上是不是有两个酶切位点那样的话就会切下一小部分，由于碱基很少，所以电泳效果是看不出来的

片段变小？
你的目的片段里有没有这个酶切位点？你的目的片段有多大？

建议用双酶切，将片段切出后电泳，如果有该片段，在电泳时就一目了然了。

不会有两个EcoRI酶切位点吧，正好酶切下一小段片段下来……

2个回答2023-01-28 07:00

因为转化过程你没出来好加点 kml 再转化提质后分别切2 这样就正确了

1个回答2023-01-12 19:57

同样的问题，我也正经历着，别着急慢慢分析原因。如果你做得是质粒的构建，我想根本的原因是没有连接上，那得重新做，考虑连接的问题。对于你的那个5天得菌液，原则上说菌液放久了，质粒可能会丢失，你可以重新...

2个回答2022-11-14 12:49

1、你的实验目的是什么？ 2、如果是克隆，连接T载体后不用酶切，直接转化菌落pcr检测有目的条带的话送样测序即可。 3、如果是做表达载体构建，pcr产物和质粒DNA酶切后与没有酶切的在同一块胶上电泳，...

1个回答2023-01-23 11:43

无外乎于试剂盒不合适，菌液过少，或过多导致裂解不充分。试剂盒问题比较大，可以其他菌液做个对照，就很清楚了当然如果是农杆菌的话，那质粒量少是很正常的，不像大肠杆菌质粒那么容易提取出来。

1个回答2023-01-20 06:45

你做完菌落PCR以后，电泳完要看看是不是你需要的那一条带，如果这条带是你要的话，你就要拿你用来菌落PCR的菌液拿去测序就可以了，因为我平时也是做菌落PCR，而且提取质粒是检测不出来的，但是菌落PCR以...

1个回答2023-05-22 05:30

都有可能你可以多做几个对照,如空载体转化、空细胞涂板等等，帮助缩问题小范围你可以询问实验室其他人员，看看酶是否有问题，感受态是否有问题，抗生素是否有问题，等等按你给的线索，菌落很少，很有可能是切...

1个回答2023-01-18 18:55

同样的问题,我也正经历着,别着急慢慢分析原因. 如果你做得是质粒的构建,我想根本的原因是没有连接上,那得重新做,考虑连接的问题. 对于你的那个5天得菌液,原则上说菌液放久了,质粒可能会丢失,你可以重新...

1个回答2022-11-14 05:01

1.用水不会有太大影响，只是质粒在水中保存不如在elution中稳定，最好还是用试剂盒的elution；2.你提的质粒是连有目的基因的话，可以空载在前，中间是marker，后边重组质粒，一般如果目的基...

1个回答2023-04-27 07:35

应为PCR扩增出来的是混合物,酶切回收后才基本是纯的目的片段. 载体一般不用PCR扩增,一般是质粒来源,也需要用切口一致的酶消化回收. 之后连起来就好了

1个回答2023-01-14 00:47

菌检条带有多大？如果是小条带，小心不要跟Dimer搞混。我还有遇见测序正确的东西P不出的，最后只能换克隆。

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