外源基因在大肠杆菌中的表达问题
1个回答
生物体对密码子的偏爱性:
不同的生物,甚至同种生物不同的蛋白编码基因,对于同一氨基酸所对应的简并密码子,使用频率并不相同,也就是说生物体基因对简并密码子的选择具有一定的偏爱性。决定这种偏爱性的因素有三:
A. 生物基因组中的碱基含量
在富含AT的生物(如单链DNA噬菌体fX174)基因组中,密码子第三位上的U和A出现的频率较高,而在GC丰富的生物(如链霉菌)基因组中,第三位上含有G或C的简并密码子占90%以上的绝对优势。
B. 密码子与反密码子相互作用的自由能适中的作用强度最有利于蛋白质生物合成的迅速进行;弱配对作用可能使氨酰基tRNA分子进入核糖体A位需要总费更多的时间;而强配对作用则可能使转肽后核糖体在P位逐出空载tRNA分子耗费更多的时间。
如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少;
如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多;
C. 细胞内tRNA的含量。
②密码子偏爱性对外源基因表达的影响
由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有不同程度的差异性,因此,外源基因尤其是哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。一般而言,有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达:
A. 外源基因全合成
B. 同步表达相关tRNA编码基因
2.载体的选择
所用表达载体必须是大肠杆菌表达载体,含有大肠杆菌RNA聚合酶所能识别的启动子(如PL、tac、T7等)和SD序列。
(1)核糖体结合位点
外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率,而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率,它们之间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘ 端的结构序列所决定,称为核糖体结合位点(RBS)
(2)大肠杆菌核糖体结合位点的特征
位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’,即Shine-Dalgarno(SD)序列,它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合,将mRNA定位于核糖体上,从而启动翻译;
不同的生物,甚至同种生物不同的蛋白编码基因,对于同一氨基酸所对应的简并密码子,使用频率并不相同,也就是说生物体基因对简并密码子的选择具有一定的偏爱性。决定这种偏爱性的因素有三:
A. 生物基因组中的碱基含量
在富含AT的生物(如单链DNA噬菌体fX174)基因组中,密码子第三位上的U和A出现的频率较高,而在GC丰富的生物(如链霉菌)基因组中,第三位上含有G或C的简并密码子占90%以上的绝对优势。
B. 密码子与反密码子相互作用的自由能适中的作用强度最有利于蛋白质生物合成的迅速进行;弱配对作用可能使氨酰基tRNA分子进入核糖体A位需要总费更多的时间;而强配对作用则可能使转肽后核糖体在P位逐出空载tRNA分子耗费更多的时间。
如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少;
如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多;
C. 细胞内tRNA的含量。
②密码子偏爱性对外源基因表达的影响
由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有不同程度的差异性,因此,外源基因尤其是哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。一般而言,有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达:
A. 外源基因全合成
B. 同步表达相关tRNA编码基因
2.载体的选择
所用表达载体必须是大肠杆菌表达载体,含有大肠杆菌RNA聚合酶所能识别的启动子(如PL、tac、T7等)和SD序列。
(1)核糖体结合位点
外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率,而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率,它们之间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘ 端的结构序列所决定,称为核糖体结合位点(RBS)
(2)大肠杆菌核糖体结合位点的特征
位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’,即Shine-Dalgarno(SD)序列,它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合,将mRNA定位于核糖体上,从而启动翻译;
相关问答
导入到大肠杆菌,那么外源基因能在大肠杆菌中表达
所以一般是用作中间过渡的载体,因为它是靠T-A连接的(T载体上含多个T,读码框未必正确。但是T载体一般不用做表达载体可以的,保证读码框正确),因为它上面有启动子,PCR产物含多聚A),后续要把这段基因...
全文外源基因连接T载体导入到大肠杆菌,那么外源基因能在大肠杆菌中表达吗?
可以的,因为它上面有启动子T7/SP6(哪个我忘记了)。 但是T载体一般不用做表达载体,因为它是靠T-A连接的(T载体上含多个T,PCR产物含多聚A),读码框未必正确,所以一般是用作中间过渡的载体,后...
全文为什么通常吧目的基因运至大肠杆菌,然后通过大肠杆菌表达呢?
细菌可以在某种条件下形成感受态,然后可以接受外界基因,而动物细胞的感受态很难做,或者干脆需要注射;另外细菌的细胞可以无限繁殖,动物细胞不可以。。。 细菌转化的局限性在于,真核生物和原核生物的表达是不同...
全文简述外源基因在大肠杆菌中高效表达的基本原理
外源基因通过载体质粒导入到了受体细胞大肠杆菌中,已经被整合到载体质粒中加以保护,因为大肠杆菌本身也存在质粒,所以外源基因不会被切割,与其它质粒一样得以表达。
什么叫大肠杆菌
大肠埃希氏菌(Escherichia coli)通常被称为大肠杆菌,是Escherich在1885年发现的,在相当长的一段时间内,一直被当作正常肠道菌群的组成部分,认为是非致病菌。直到20世纪中叶...
全文大肠杆菌是什么病?
大肠杆菌不是病,大肠杆菌是与我们日常生活关系非常密切的一类细菌,学名称作“大肠埃希菌”,属于肠道杆菌大类中的一种。 它是寄生在人体大肠和小肠里对人体无害的一种单细胞生物,结构简单,繁殖迅速,培养容易,...
全文大肠杆菌应用
现在便秘的人这么多,市场是非常大的
人体内的大肠杆菌是如何产生的?
大肠杆菌是人和动物肠道中的正常栖居菌,婴儿出生后即随哺乳进入肠道,与人终身相伴。 其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长,减少蛋白质分解产物对人体的危害,还能合成维生素B和K,以及有杀菌作...
全文外源基因连接T载体导入到大肠杆菌,那么外源基因能在
可以的,因为它上面有启动子。 但是T载体一般不用做表达载体,因为它是靠T-A连接的(T载体上含多个T,PCR产物含多聚A),读码框未必正确,所以一般是用作中间过渡的载体,后续要把这段基因切下来(你的扩...
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